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Detección y pronóstico de células
cancerosas en etapas tempranas NSCLC

madre

Octubre 2023 DOI:10
...
3
...
0

Traducido del inglés al español Por Yony Sánchez
Chandouri, Boutaîna & Naves, Thomas & Yassine, May & Ikhlef, Léa & Tricard, Jérémy & Chaunavel, Alain & Pannequin, Julie & Girard,
Nicolas & Durand, Stephanie & Carré, Vincent & Lalloué, Fabrice
...
Cancer stem cells detection and prognosis in early stages
NSCLC
...
21203/rs
...
rs-3423481/v1
...
researchgate
...
org/0009-0006-7224-6589
Thomas Naves
UMR INSERM 1308 CAPTuR, Faculty of Medicine, University of Limoges, Limoges, France
https://orcid
...
org/0009-0008-5701-2674
Léa Ikhlef
UMR INSERM 1308 CAPTuR, Faculty of Medicine, University of Limoges, Limoges, France
https://orcid
...
org/0000-0001-6211-1097
Alain Chaunavel
Department of Pathology, Dupuytren University Hospital, Limoges, France
https://orcid
...
org/0000-0002-9956-373X
Nicolas Girard
Thorax Institute Curie Montsouris, Institut Curie, Paris, France
...
org/0000-0001-9909-2299
Stephanie Durand
UMR INSERM 1308 CAPTuR, Faculty of Medicine, University of Limoges, Limoges, France
https://orcid
...
lalloue@unilim
...
org/0000-0003-0382-4948
Keywords: NSCLC, cancer stem cells, biomarkers, prognosis, early-stage
Posted Date: October 12th, 2023
DOI: https://doi
...
21203/rs
...
rs-3423481/v1

License: This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4
...
Read Full License

Resumen
Antecedentes
A pesar de los avances en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer de pulmón, las terapias aún no logran
mejorar la gestión de los pacientes debido a los mecanismos de resistencia y las recaídas
...
Sin embargo, faltan marcadores
específicos y adicionales de CSC
...

Métodos
La detección y clasificación de las CSC pulmonares se evaluaron mediante experimentos in vitro e in vivo
con una lectina MIX
...
Estos son dispositivos utilizados en biología molecular para analizar múltiples genes o
secuencias de ADN simultáneamente
...
) de tejido

en un estudio retrospectivo con 221 pacientes de CPNM
...
El estudio retrospectivo validó el valor pronóstico

de MIX en la supervivencia global de los pacientes en etapas tempranas
...

Conclusión
Nuestros resultados demuestran que las CSC identificadas por MIX podrían proporcionar una herramienta
pronóstica que permita a los médicos clasificar mejor a los pacientes en etapas tempranas con alto riesgo
de recaída para adaptar las decisiones de tratamiento
...
A pesar de los
avances en el diagnóstico y el tratamiento, la quimioterapia y las terapias dirigidas tienen una eficacia
reducida debido a los mecanismos de resistencia heterogéneos
...
Después de la
cirugía de pulmón, la falta de tratamientos dirigidos requiere un seguimiento a largo plazo para prevenir la
recaída
...

Cada vez hay más evidencia que sugiere la presencia de CSC en varios tipos de tumores incluso después del
tratamiento, y contribuyen a la resistencia a la terapia y a la recaída de la enfermedad
...
Los posibles marcadores de
CSC en el pulmón incluyen marcadores de superficie (CD133, EpCAM), factores de transcripción nucleares
(Nanog, Oct4, Sox2) y la enzima ALDH1A1(8)
...

Los marcadores de CSC existentes carecen de especificidad y confiabilidad, y las técnicas actuales de
detección y aislamiento tienen limitaciones(9, 10)
...

Además, se ha reconocido durante muchos años que los cambios post-traduccionales podrían ser
marcadores relevantes de células madre que desaparecen durante el proceso de diferenciación (11, 12)
...
Mientras que la proteína CD133 está presente tanto en
las CSC como en las células tumorales diferenciadas, el epítopo AC133 está selectivamente enmascarado y
expresado solo en las CSC(12)
...

Previamente desarrollamos un nuevo enfoque para detectar CSC a partir de una población heterogénea de
células tumorales
...
La
importancia de este nuevo método para detectar CSC se ha demostrado por primera vez en el cáncer de
colon(13)
...
La tinción de ColoSTEM supera al marcador estándar Oct-4 en la distinción entre CSC y células

tumorales no madre y células sanas, lo que sugiere su eficacia en la predicción de la agresividad del tumor
y la respuesta terapéutica en pacientes con cáncer de colon
...

Aquí, mostramos la detección de CSC en el CPNM utilizando un enfoque similar con una combinación
específica de lectinas (MIX) que reconocen patrones glicosilados expuestos en la superficie celular
...
Así, hemos validado los motivos glicosilados específicos de CSC como
biomarcadores para predecir la agresividad y el pronóstico del cáncer de pulmón en etapas tempranas
...


Materiales y Métodos
Cultivo Celular
La línea celular humana de CPNM A549 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC®, Francia)
...

Para el cultivo tridimensional (3D), se utilizó un medio definido compuesto por medio DMEM/F12 1X
(Thermo Fisher, Francia) suplementado con B27 1X (Thermo Fisher, Francia), 10 ng/mL de FGF (Peprotech,
Francia) y 20 ng/mL de EGF (Peprotech, Francia)
...


Tejidos tumorales pulmonares de pacientes
El estudio involucró a dos cohortes de pacientes
...
15 años (+/- 0
...
Los pacientes del Hospital Universitario de Lyon fueron
recogidos bajo un consentimiento amplio y proporcionados por el Biobanco de Pulmón del HCL (Número de
acuerdo: R4-P1-ST1
...
CRB-HCL)
...
2),
con 36 pacientes en etapas tempranas y 24 pacientes en etapas avanzadas (Tabla 1)
...
Esta MIX y método se describieron por primera vez en dos patentes
(FR20150061763 - WO2016FR53196; WO2016FR53197- FR20150061764) relacionadas con el cáncer de
colon
...
Experimentos preliminares permitieron
demostrar la relevancia clínica de este método en la detección de CSC en pacientes con cáncer de colon
...
Este método se adaptó para caracterizar las CSC pulmonares y resultó en la adición de dos

nuevas patentes (FR20170055137; FR20170055139 - WO2018FR51280) basadas en una proporción
específica de la MIX de lectinas (UEA-1 y GSL-I)
...


Separación de células fluorescentes de LungSTEM
Una suspensión de 2x10^7 células/mL se separó por FACS (ordenadores BD FACSAria™ III para la separación
de células individuales) basada en una LungSTEM
...
Se excluyeron las células
moribundas de la separación añadiendo yoduro de propidio (PI)
...
Luego, las
células fueron incubadas durante 30 minutos, lavadas con PBS, fijadas durante 10 minutos en 4% de PFA y
analizadas con un CytoFLEX (Beckman Coulter, EE
...
El análisis de datos se realizó utilizando el software
Kaluza (v2
...
UU
...
Para el ensayo clonogénico, las células
separadas se sembraron en placas de 96 pocillos de baja adherencia (marca Falcon Corning, Francia) a
densidades celulares decrecientes (1000, 100, 10 y 1 célula) para evaluar su potencial clonogénico
...

Semanalmente, se agregaron 50 microlitros de medio a cada pocillo, y este proceso continuó durante un
período de 4 a 8 semanas
...
Los esferoides se capturaron de manera consistente a intervalos regulares,
precisamente cada 7 días (Día +7)
...


Ensayo de Viabilidad Celular
Para cada condición, se separaron y sembraron 1500 células en una placa de 96 pocillos
...

Después de 72 horas de incubación, se añadió el reactivo del kit de viabilidad celular (Promega, WI, EE
...
)
siguiendo las instrucciones del fabricante y se midió la luminiscencia con un lector de placas EnSpire®
Multimode (PerkinElmer, EE
...
El IC50 se determinó gráficamente con el software GraphPad Prism 7
...


Extracción de ARN y RT-qPCR
Se extrajo ARN total con el kit Quick-RNA Microprep (Zymo R1051, EE
...
Se realizó la síntesis de cDNAs
con el kit cDNA Archive (Applied Biosystems, MA, EE
...
) y se realizaron qPCR con el kit SensiFAST Probe
Hi-ROX (Bioline, Londres, Reino Unido) en un sistema QuantStudio 5 (Thermo Fisher, Francia)
...


Western-Blot
Las células se lisaron utilizando un tampón RIPA (Thermo Scientific™, Francia), se centrifugaron y se
determinó la concentración de proteína utilizando un ensayo de proteína Bradford (BioRad)
...
Luego, las membranas se
incubaron con anticuerpos secundarios (Dako Cytomation) durante 1 hora y se revelaron utilizando un GBox (Syngene, Fisher Scientific, Francia)
...
Al día siguiente, se
crearon heridas con un WoundMaker™ (Sartorius, Gotinga, Alemania) siguiendo las instrucciones del
fabricante
...
La migración celular se monitoreó
con Incucyte (Sartorius, Gotinga, Alemania) cada 2 horas durante 48 horas con Rapid Red Nuclight
(NC1404054, Sartorius, Gotinga, Alemania)
...


Ensayo de Invasión
Los esferoides se incrustaron en 100 μL de Matrigel® (Corning, 356255, EE
...
) a 100 μg/mL en una placa
de 96 pocillos y se añadieron 100 μL de medio de cultivo
...
La invasión en Matrigel® se midió con el
programa de análisis de macros Fiji con el software ImageJ(14)
...
Las secciones se tiñeron con una mezcla
pre-diluida en diluyente y se detectaron con el kit de Detección Bond Intense R y el kit de Detección Bond
Polymer Refine Red (Leica, Francia)
...
0 Hamamatsu (Hamamatsu Photonics, Massy, Francia)(13)
...
Un método de puntuación basado
en un umbral de tinción del 30% categorizó a los pacientes como "Tinción baja" o "Tinción alta"
...
Además, para evaluar la eficacia de MIX en reconocer
solo las CSCs, utilizamos 62 tejidos pulmonares no tumorales de Tissue Microarray (TMA) como controles
MIX negativos, que fueron proporcionados por AMSBIO
...

La tasa de proliferación se evaluó con el anticuerpo Ki67 (clon 30-9, Ventana-Roche Medical Systems)
siguiendo los protocolos proporcionados por los fabricantes de anticuerpos en los departamentos de
patología del Hospital Universitario de Limoges
...


Análisis Estadístico
El software estadístico utilizado en este estudio fue Prism 7 (GraphPad, EE
...
) o el entorno R (versión
4
...
3)
...
El valor pronóstico de cada parámetro para el resultado (supervivencia
global y supervivencia libre de recaída) se evaluó utilizando el método de Kaplan-Meier y la prueba de logrank (Mantel-Cox)
...
El análisis multivariado se realizó
utilizando un modelo de regresión de Cox sobre las características individuales identificadas por el modelado
de Cox invariado
...
Se verificó la suposición de proporcionalidad de riesgos para el ajuste del modelo de regresión
de Cox utilizando la función cox
...
Se consideró significativo un valor de p
por debajo de 0
...


Resultados
Diferenciación de células con propiedades de pluripotencia de una subpoblación heterogénea de células
tumorales basada en un patrón de glicosilación específico
...
Para demostrar que las CSCs
podían ser separadas con un MIX específico de la línea celular de cáncer A549, realizamos análisis FACS
...
1A)
...
1B)
...
El análisis transcriptómico
realizado mediante RT-qPCR confirmó que los genes relacionados con las CSCs (Nanog, AC133, Oct4, EpCAM,
Sox2) aumentan significativamente en las células ordenadas positivas para MIX en comparación con las
células negativas para MIX o las no ordenadas (Fig
...
Curiosamente, en comparación con las células
negativas para MIX, los marcadores de proteínas relacionados con las CSCs (Nanog, AC133, Oct4, EpCAM,
Sox2) están sobre expresados en las células positivas para MIX, como se mostró tanto en la inmuno
transferencia (Fig
...
1F, G)
...
Como se intentó, las
células positivas para MIX, caracterizadas por su firma única de glicanos, exhibieron una capacidad de
autorrenovación significativamente mayor (p = 0
...
Esto fue significativamente evidente a través del mayor número y tamaño de los esferoides (p <
0
...
1J, H e I)
...
001) en las células
ordenadas positivas para MIX en comparación con las células no ordenadas y negativas, lo que sugiere que
las células positivas presentan estas habilidades de resistencia propias de las CSCs (Fig
...

Estos hallazgos sugieren que las células positivas para MIX comparten propiedades similares a las CSCs
ordenadas por CD133 (AC133)
...

Sorprendentemente, encontramos que la fracción Mix + tenía una capacidad significativamente mayor de
formar esferoides (p = 0
...
S1A, B, C)
...
003) en

comparación con los formados por las células AC133 +
...
La subpoblación MIX + mostró
un IC50 significativamente más alto (p = 0
...

S1D, E)
...

Así, nuestros datos revelaron que el MIX es más selectivo para las CSCs pulmonares en comparación con el
método de clasificación basado en el anticuerpo AC133
...


Las células ordenadas con MIX expresan marcadores y propiedades funcionales de la
transición epitelial a mesenquimal (EMT)
...
Por lo tanto, realizamos pruebas de raspadura de cicatriz y de
invasión después de la clasificación de células mediante FACS basada en la tinción MIX
...
001, curva naranja) y no
ordenadas (p < 0
...
2A, B)
...
Sorprendentemente, observamos que las células
ordenadas positivas para MIX mostraban una regulación positiva significativa de estos marcadores (p <
0
...
2C, D)
...
Notablemente, se observó un halo distintivo de células invasoras alrededor
de los esferoides solo en las células MIX + y no ordenadas
...
2E, F)
...
Estos resultados sugieren que in vivo, las células MIX + presentarían un
comportamiento más agresivo que otra fracción celular
...

Para demostrar que las células MIX + podrían estar relacionadas con las CSCs, se analizó la tumorigenicidad
de MIX + en un hospedador animal inmunocomprometido
...
3A
...

3A)
...
3B)
...
3B)
...
Dado que se requiere un número limitado de células MIX positivas (50

células) para iniciar tumores, podemos concluir que las células Mix + con sus características similares a las
células madre serían más agresivas
...
De
hecho, los tumores derivados de MIX + tenían un volumen tumoral promedio 6 veces mayor que los tumores
derivados de otras células (p = 0,0005)
...
Es importante
destacar que las células MIX + lograron un volumen tumoral promedio que superó los 100 mm3 en 40 a 45
días después de la inyección de 500 células, mientras que ningún tumor alcanzó este tamaño con MIX- (Fig
...
Estos resultados sugieren que los tumores obtenidos después de la inyección de la subpoblación
ordenada con MIX + siguen siendo más agresivos que los obtenidos con la subpoblación ordenada con MIXRealizamos una evaluación de las tasas de proliferación celular en los tumores utilizando tinción con Ki67
...
3D, E)
...


Detección de pacientes con NSCLC con células MIX +
...
En estas condiciones, decidimos estudiar su
relevancia clínica en la discriminación de tejido sano de tejido tumoral pulmonar
...
La
tinción con MIX se realizó en 221 tejidos tumorales de dos cohortes diferentes (del Hospital de la Universidad
de Lyon y AMSBIO) (Tabla 1)
...
4A, Tabla 1)
...
17; vs Clase de edad: p
= 0
...
33)
...

Ninguno de los tejidos no tumorales presentó células positivas después de la tinción con MIX, lo que indica
una excelente especificidad (100%)
...
1% (Fig
...
La curva
ROC construida a partir de los resultados de la tinción MIX en tejido pulmonar no tumoral y tumoral permitió
establecer que el AUC es aceptable (AUC = 0
...
78-0
...
4B)
...
(Fig
...


Evaluación de la clasificación de pacientes con NSCLC basada en la agresividad del
tumor y el valor pronóstico de la tinción MIX +
En segundo lugar, nuestro objetivo fue evaluar si las células MIX-positivas podrían predecir la recaída del
paciente o el pronóstico de supervivencia
...
Se debe tener en cuenta que el análisis de la OS se realizó en todos los pacientes (n =
221) de las cohortes de HCL y AMSBIO (Tabla 1), mientras que el análisis de la RFS se realizó solo en la
cohorte de HCL (n = 70), ya que AMSBIO no pudo proporcionar información sobre la recurrencia disponible
...
13; Fig
...
3 con un IC del 95% de 0
...
95,
p = 0
...
5A)
...
24 y p = 0
...
Sin embargo, el análisis de la OS demuestra que la
etapa tardía (III/IV) es un factor de mal pronóstico (HR: 2
...
9 a 4
...
6x10−8;
Fig
...
Dado que el análisis multivariante reveló que las etapas tardías y una puntuación MIX alta eran
factores pronósticos independientes para el resultado de los pacientes (Fig
...
Así, las curvas de supervivencia
destacan que una alta tinción MIX es un factor de mal pronóstico en las etapas tempranas del NSCLC (p =
0
...
91,
datos no mostrados)
...
1 (IC del
95%: 1
...
83, p = 0
...
Para estimar con precisión el valor pronóstico de la tinción
MIX de acuerdo con las etapas dadas, se realizaron análisis de supervivencia (Kaplan-Meier y regresión de
Cox univariante) de acuerdo con las subpoblaciones MIX-Baja o Alta en etapas tempranas (I/II) o tardías
(III/IV) (Fig
...
La tinción MIX-Alta podría considerarse claramente como un marcador de mal pronóstico
solo en las etapas tempranas
...
Solo el sexo y la
etapa tienen un valor pronóstico significativo para la recurrencia en el NSCLC y la tinción MIX pareció no ser
informativa (datos no mostrados)
...
Mostramos que los pacientes
en etapas tardías con una tinción MIX-Alta parecen tener una peor supervivencia global (p = 0
...
6A)
en comparación con los pacientes en etapas tempranas con baja tinción
...
1 con un IC del
95%: 1
...
14, p = 0
...
6A)
...
Curiosamente, podría
reflejar la carga de CSCs en muestras de tumores y, por lo tanto, podría ser clínicamente valioso para predecir
los resultados de los pacientes con adenocarcinoma de pulmón en etapa temprana y podría ayudar en la
toma de decisiones sobre el tratamiento al proporcionar información sobre el riesgo de recaída
...
Esta población de células
contribuye a la heterogeneidad de los tumores de pulmón y desempeña un papel en la resistencia tumoral
a los tratamientos convencionales (16)
...

Dado que aún no se ha desarrollado un tratamiento específico para dirigirse directamente a las CSC, su
detección temprana podría mejorar la gestión del paciente y la implementación de ensayos clínicos
destinados a eliminar las CSC
...
Varios estudios han demostrado que los marcadores de CSC comúnmente reconocidos,
como CD133, no se expresan exclusivamente en las CSC de los tumores (12),(17),(18)
...
Por lo
tanto, desarrollar métodos eficientes para detectar específicamente las CSC es esencial para aplicaciones
clínicas y la investigación traslacional
...
Este enfoque se basa en el reconocimiento específico de los motivos de glicanos expresados
por las CSC de pulmón
...
La efectividad y confiabilidad de la
combinación de lectinas ya se ha demostrado para detectar células similares a las células madre de cáncer
en poblaciones de células de cáncer de colon (13)
...
Los primeros resultados demostraron que las
células MIX-positivas representaban el 1% de la subpoblación de células tumorales, que son muy similares
al porcentaje de CSC y sobre expresaban tanto los genes como los marcadores de proteínas relacionados
con las CSC comunes (7, 15, 19)
...
Este hallazgo se correlaciona con una mayor recurrencia tumoral y un mal
resultado clínico
...
El experimento de quimo
sensibilidad confirmó que las subpoblaciones MIX-positivas están dotadas de resistencia a la terapia
convencional en comparación con las células MIX-negativas
...
Además, estos
cambios en la agresividad celular están acompañados de modificaciones fenotípicas, como la expresión de
la firma génica relacionada con la transición epitelial a mesenquimal (EMT)
...
En consecuencia, las células clasificadas MIX + exhiben propiedades similares a las CSC
...
Este paso era necesario porque estudios anteriores, incluido
uno que examinó 145 casos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en etapa I, revelaron que
la sobreexpresión de CD133 por sí sola no era un predictor confiable de recurrencia o supervivencia general,
en línea con estudios anteriores (22),(23)
...
De hecho, la presencia de CSC en la sección de tumores incrustados podría ser
útil para discriminar el tumor de las células sanas Por lo tanto, la sensibilidad y especificidad de MIX para
detectar el NSCLC se estimaron mediante la inmunohistoquímica y mostraron una alta especificidad (100%)
y una sensibilidad de aproximadamente el 72%
...
Estos datos son de suma
importancia, ya que, aunque el NSCLC se diagnostica en etapas tempranas, casi una cuarta parte de los
pacientes desarrolla recaídas y muere a causa de una enfermedad recurrente (24)
...
En este contexto,
el valor pronóstico de la puntuación MIX en el NSCLC en etapas tempranas podría mejorar el seguimiento
de los pacientes y reducir el riesgo de recaída
...
La combinación de lectinas podría
permitir estrategias terapéuticas personalizadas en el futuro
...


Conclusión
La identificación de la carga de las CSC con la mezcla de lectinas podría ofrecer una valiosa herramienta
pronóstica complementaria en pacientes con NSCLC en etapas tempranas, lo que podría dar lugar a la
aparición de estrategias terapéuticas personalizadas dirigidas a las CSC en el futuro
...
Este
nuevo avance debería permitir a los médicos estratificar mejor a los pacientes y optimizar la selección del
tratamiento en función de la presencia de células madre de NSCLC, lo que conducirá a mejores resultados
...
También nos gustaría agradecer al equipo de Fabienne
Gouzy Grosjean en el technopole de patología de Saint-Étienne (Francia) por el análisis a ciegas de las
diapositivas de IHC
...
También agradecemos
a Manuella Corre-Delage y a los patólogos del Departamento de Patología
...
BC planificó y llevó a cabo los
experimentos
...
BC, TN, SD, VC, FL
analizaron e interpretaron los datos (Análisis Formal)
...

NG organizó la inscripción clínica y las muestras, y NG, JT analizaron los datos clínicos
...
BC, TN, MY, LI, JT, SD, VC, FL escribieron el manuscrito
...

Todos los autores aprobaron la versión final
...
1
...
El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki
...

Información sobre la financiación La beca de doctorado (n°2020/0602) fue respaldada por la ANRT
(Asociación Nacional de Investigación y Tecnología)
...

A
...
Abajo, expresión de patrones glicosilados detectados por MIX
...
Representaciones gráficas de FACS que muestran el reconocimiento de
patrones glicosilados por MIX después de la adición (en el panel izquierdo) o no adición de 2 μg/mL de Tunicamicina
...
Niveles de expresión de ARN
de genes de células madre cancerígenas (AC133 (Prom1), Nanog, Oct4 (Pouf5) y Sox2) en diferentes subpoblaciones ordenadas (MIX+, MIX- y células
no ordenadas)
...
Western Blot muestra la expresión de proteínas relacionadas con células madre cancerígenas en cada subpobla ción ordenada
(MIX+, MIX- y células no ordenadas)
...
Cuantificaciones de Western Blot normalizadas a células no ordenadas de tres réplicas
...
Representaciones
gráficas de citometría de flujo que muestran la expresión relativa de AC133 y EpCAMhigh después de la ordenación de células individuales por FACS
en MIX en comparación con células no ordenadas
...
Histograma que representa los porcentajes de EpCAMhigh y AC133+ analizados por citometría
de flujo dentro de las células MIX+, MIX- y no ordenadas
...
Capacidad clonogénica después de la ordenación de células individuales por FACS
...
I
...
J
...
Los tamaños de las esferas
se controlaron cada D+7 durante 80 días
...
Histograma que representa la resistencia a la Cisplatina de las células MIX+, MIX- y no ordenadas después
de la ordenación de células por FACS y siembra de 1500 células por pozo
...


Implicación de las células madre MIX+ en la migración e invasión
A
...
B
...
El porcentaje de curación de heridas se midió utilizando
el software IncuCyte 2022 Rev1
...
Western Blot muestra los niveles de proteínas relacionadas con la transición epitelial-mesenquimal (EMT) en
cada subpoblación ordenada (MIX+, MIX- y células no ordenadas)
...
Cuantificaciones de Western Blot normalizadas a células no ordenadas de tres
réplicas
...
Imágenes representativas de las capacidades de invasión de esferoides después de 5 días de incubación en inserciones revesti das de
Matrigel, en cada subpoblación ordenada (MIX+, MIX- y células no ordenadas)
...
Histograma que representa la capacidad relativa de invasión de
esferoides de cada subpoblación ordenada (MIX+, MIX- y células no ordenadas)
...

La invasión en Matrigel se midió restando el área total del área central, utilizando el programa de análisis Fiji Macro
...


Caracterización in vivo de la eficacia de MIX en la detección de CSCs pulmonares: Potencial tumorigénico de las células MIX+ y MIX- aisladas de A549
A
...
Las células orden adas MIX+ y MIX- se
trasplantaron subcutáneamente en ratones sin pelo
...
Ilustración que representa el número de tumores formados (tumor >100 mm3) por ratones
de acuerdo al número decreciente de células inyectadas de cada subpoblación (MIX+ y MIX-)
...
Curva de crecimiento de tumores que representa
la evolución del tamaño del tumor después de la inyección de 500 células en cada ratón durante 1 a 60 días
...
C
...
D
...
E
...

Todos los resultados se representan como media ± SEM, ns no es un resultado significativo, * valor de p < 0,05 ** valor de p < 0,01, *** valor de p
< 0,001 utilizando la prueba de ANOVA de una vía (n = 3 experimentos)
...

Se muestran ilustraciones representativas de la tinción MIX (en color marrón), tal como se observa mediante IHC (inmunohistoquímica) (ampliación
de 200x)
...
La curva característica de operación del receptor (ROC) de MIX y, sobre todo, los parámetros de rendimiento de la clasificación
...

A
...
El
análisis multivariado se realizó con las características que tenían un valor de p inferior a 0
...
B
...
HR, riesgo; C
...
, intervalo de confianza
...

Figura 6
Análisis de la supervivencia libre de recaída (A) y la supervivencia global (B) según la etapa pTNM (etapa temprana y etapa avanzada) de pacientes
con NSCLC y la intensidad de la tinción MIX (baja/alta)
...

pTNM: Tumor-Ganglio-Metástasis de patología
...
researchgate
...
5 and Grammarly
...
2

---